但是新教國家英、荷與先期航來的舊天主教國家西、葡之間矛盾重重，前者因此在家康面前大進讒言，說天主教傳教士乃是妄圖將日本變成殖民地的西、葡國王派來的間諜。家康本就不滿天主教宣揚上帝萬能從而淡化世俗領主的權威，進而看到很多九州諸侯通過與西、葡等國通商獲得了大批物資和武器，認為如果不加限制地任其發展，將會動搖幕府的統治基礎，恰巧就在此時，發生了著名的“岡本大八事件”，促使家康頒發了禁令。

且說慶長十五年(1610年)，肥前日野江大名有馬晴信和葡萄牙商船耶穌號發生沖突，最終將耶穌號擊沉，晴信以此向幕府表功，并且進獻給老中本多正純的家臣岡本大八大筆財物，希望大八能夠幫忙進言，恢復有馬氏的舊日領地。然而岡本大八接受賄賂卻不肯辦事，有馬晴信越等越急，愚蠢地直接越過大八去催促本多正純——賄賂事件就這樣暴露了。幕府將岡本大八打入大牢，嚴刑拷問，大八反咬一口，供出有馬晴信勾結傳教士和西、葡商人的諸多不法事。于是幕府將岡本大八以火刑處死，將有馬晴信先是流放到甲州都留郡，進而勒令其切腹自殺——身為天主教徒的晴信不肯自盡，命令家臣將自己刺死了。

以“岡本大八事件”為導火索，德川家康對天主教的反感變得更加強烈，不久后就下達了第一次“禁教令”，在幕府直轄領地和有馬氏的舊領中嚴禁傳播和信奉天主教。慶長十七年(1612年)八月，禁教范圍擴大到日本全國，各地教堂陸續被破壞，日本籍天主教徒紛紛遭到逮捕，被強迫改變信仰。不肯改變信仰的教徒遭到游街、流放和處死的命運——其中一百四十八名被流放馬尼拉，包括著名的切支丹大名高山右近、內藤如安等人。

到了元和二年(1616年)八月，二代將軍秀忠頒布了第二次“禁教令”，對天主教徒進行殘酷迫害，很多人因為不肯改變信仰而被活活燒死，史稱“大殉教”。元和六年(1620年)，又發生了“平山常陳”事件，標志著日本正式開始“鎖國”體制。

平山常陳本是一艘朱印船的船長，因為坐船為中國式平底船，在從馬尼拉回歸日本途中，被荷蘭船誤認為是中國船而遭到逮捕。在搜查平山船的時候，荷蘭人意外地發現了兩名西班牙傳教士，于是如獲至寶地進獻給德川幕府。幕府經過審訊后，將平山常陳和兩名傳教士全都處以火刑，其余十二名船員也盡皆處死。

從此宗教迫害擴大為貿易限制，葡萄牙人首先遭到驅逐，然后是英國人，最后在寬永元年(1624年)嚴禁西班牙船只來航。日本船只除朱印狀外，還必須得到“老中奉書”才許出海，居住在外國的日本人也一律嚴禁歸國，歸即處死。

日本就此基本斷絕了南蠻貿易，唯一例外的是荷蘭人，荷蘭東印度公司在日本設置了分公司，向幕府保證絕不傳播基督教，同時荷蘭商船一到日本，商館館長立刻向幕府提交《荷蘭風說書》，報告海外情況。但即便是荷蘭人也只準在長崎的出島建造商館，而不得踏入日本內地一步，就連中國船也只準停泊在長崎港，可以說，整個日本只有長崎一地是半對外開放的，幕府通過直接統治長崎而壟斷了所有對外貿易。

有壓迫，必然就有反抗，驚世駭俗的“島原、天草之亂”就在這種禁教鎖國的背景下爆發了。