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血清脂蛋白電泳原理和操作方法

2017-06-15 08:13:13  來源:360常識網   熱度:
導語:血清脂蛋白,當前在臨床應用方面,它的作用還是比較大的,所以對于很多的患者,就想全面了解一下血清脂蛋白電泳原理和操作方法,為了你能盡

血清脂蛋白,當前在臨床應用方面,它的作用還是比較大的,所以對于很多的患者,就想全面了解一下血清脂蛋白電泳原理和操作方法,為了你能盡快的了解,下面內容就做了詳細的介紹,你可以充分的了解一下,相信會對自己以后有幫助.

原理

脂蛋白是在堿性pH條件下,以瓊脂糖凝膠或醋酸纖維條帶作為載體,從陽性方向來進行分離的。形成的蛋白區帶可以用脂肪染料如蘇丹黑或者油紅染色,它們只用于脂蛋白染色。在瓊脂中可能會有附加的聚陰離子和二價陽離子沉淀。脂蛋白沉淀帶用光密度計可立即定量分析。脂蛋白區帶也可以被切開后重新溶解,對各區帶進行膽固醇濃度的直接酶法檢測。另外,有報道在用薄層瓊脂糖凝膠上進行電泳分離后,可直接檢測各脂蛋白組分中的膽固醇含量的方法。

操作方法

(1)將緩沖液加入電泳槽內,調節兩側槽內的緩沖液,使其處于同一平面。

(2)醋酸纖維素薄膜的準備:取醋酸纖維素薄膜(2cm×8cm)在毛面的一端(負極側)1.5cm處用鉛筆輕劃一橫線,做點樣標記。編號,并標明正、負極后,將薄膜置于巴比妥-巴比妥鈉緩沖液中浸泡,待充分浸透后(一般為20min)取出,夾于潔凈濾紙中間吸去多余的緩沖液。

(3)將醋酸纖維素薄膜毛面向上貼于電泳槽支架上拉直。用微量吸管吸取無溶血血清3~5μl于橫線處沿橫線加樣,樣品應與薄膜的邊緣保持一定的距離,以免電泳圖譜中的蛋白區帶變形,待血清滲入薄膜后,反轉薄膜,使光面朝上,平直地貼于電泳槽支架上,用雙層濾紙或四層紗布將薄膜的兩端與緩沖液連通,稍待片刻。

(4)接通電源,注意醋酸纖維素薄膜上的正、負極,切勿接錯。電壓90~150V,電流0.4~0.6mA/cm(不同的電泳儀所需電壓,電流可能不同,應靈活掌握),夏季通電45min,冬季通電時間稍長,約為60min,電泳區帶展開約25~35mm即可。

(5)染色:通電完畢,取下薄膜直接浸于麗春紅S染液或氨基黑10B染色液中,染色5~10min(以白蛋白區帶染透為止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景無色為止。

(6)定量:

①比色法:將漂洗的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白區帶入相應的試管中,在白蛋白管中加0.4mol/L氫氧化鈉6ml(計算時吸光度乘以2),其余各管加3ml,振搖數次,置37℃水箱20min使其色澤浸出。氨基黑10B染色用分光光度計在620nm處讀取各管吸光度,然后計算出各管的含量(同時做空白管對照)。

麗春紅S染色時浸出液用0.1mol/L氫氧化鈉,加入量同上法。10min后,白蛋白管內加400ml/L醋酸0.6ml(計算吸光度時乘以2),其余各管加0.3ml,以中和部分氫氧化鈉,使色澤加深,必要時離心,取上清液用分光光度計在520nm處讀取各管的吸光度(同時作空白對照),然后計算各自的含量。

②光密度計掃描法:A.透明:吸去薄膜上的漂洗液(為防止透明液被稀釋影響透明結果),將薄膜浸入透明液中2~3min,然后取出,以滾動的方式平貼于潔凈無劃痕的載物玻璃片上(切勿產生氣泡),將此玻片豎立片刻,除去多余透明液后,置于恒溫90~100℃的烘箱內,烘烤10~15min,取出冷卻至室溫,用此法透明的各蛋白區帶鮮明,薄膜平整,可供直接掃描和永久保存(用氫萘或液體石蠟透明,應將漂洗過的薄膜烘干后進行透明,此法透明的薄膜不能存久,且易發生皺折)。②掃描定量:將已透明的薄膜放入全自動光密度計或其他光密度計暗箱內,進行掃描分析。

血清脂蛋白電泳原理和操作方法,本篇的內容就為很多的患者,做了詳細的介紹,所以要想全面的了解,可以通過以上的介紹,具體的了解一下它的原理,以及操作的方法,相信通過了解,就能具體對原理和操作方法有一個充分的認識。

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